La electrofisiología hipocampal in vitro y el EEG cuantitativo in vivo revelaron efectos neurofisiológicos sólidos del agente antivértigo Vertigoheel® en un estudio con ratas
Wilfried Dimpfel, Universidad Justus Liebig Giessen, Giessen, Alemania.
Bernd Seilheimer, Biologische Heilmittel Heel GmbH, Baden-Baden, Alemania.
Leonie Schombert, NeuroCode AG, Wetzlar, Alemania .
Abstracto
El vértigo es un síntoma común que afecta a la vida diaria. En estudios anteriores se ha demostrado que Vertigoheel ® (VH-04) es eficaz para el vértigo. Este artículo tiene como objetivo investigar el modo de acción del medicamento VH-04 en el cerebro de la rata. En un estudio in vitro, se realizó un registro neurofisiológico de cortes del hipocampo de ratas Sprague Dawley ® macho adultas para corroborar un posible efecto directo en el cerebro de VH-04 en diferentes concentraciones. En un estudio cruzado in vivo con 11 ratas Fischer 344 ® , se aplicó un método neurofisiológico para analizar sistémicamente la actividad de VH-04 en el cerebro de la rata. Este método combina evaluaciones cuantitativas de potenciales de campo transmitidos telemétricamente después del tratamiento farmacológico con un análisis discriminante posterior para clasificar el compuesto. La base de datos utilizada para el análisis de la clasificación contenía numerosos productos químicos y medicamentos de diferentes dosis, todos probados en el mismo paradigma, que es la monitorización inalámbrica continua del EEG de ratas en movimiento libre antes y después de la ingesta del medicamento. Tras la aplicación de estímulos únicos a las colaterales de Schaffer en presencia de VH-04 en diferentes concentraciones, las respuestas in vitro de las células piramidales aumentaron en función de la concentración de VH-04 (0,25 – 4 ml/L). Los resultados fueron estadísticamente significativos para concentraciones superiores a 2,5 ml/L. La potenciación a largo plazo se vio afectada sólo marginalmente. De varios antagonistas específicos del receptor de glutamato, el efecto de VH-04 sólo fue antagonizado por la señalización mediada por el receptor de AMPA y ácido kainico. Su potenciación indica un mejor procesamiento de la información en el hipocampo, una estructura cerebral implicada principalmente en los procesos de memoria. La caracterización in vivo de los cambios inducidos por VH-04 en las firmas de EEG de cuatro áreas cerebrales (la corteza frontal (FC), el hipocampo (HC), el cuerpo estriado (ST) y la formación reticular (RF)) reveló una atenuación dependiente de la dosis de las ondas delta, theta, alfa 2 y beta 1. El análisis de la función discriminante posterior clasificó la firma EEG VH-04 en un subconjunto de productos medicinales que mejoran la cognición.
Palabras clave
EEG , modelo de rata , sistema nervioso central , vértigo , VH-04 , neurofisiología , hipocampo , multiobjetivo , transformación rápida de Fourier
Dimpfel, W., Seilheimer, B. y Schombert, L. (2019) La electrofisiología del hipocampo in vitro y el EEG cuantitativo in vivo revelaron efectos neurofisiológicos robustos del agente antivértigo Vertigoheel ® en un estudio con ratas. Neurociencia y medicina , 10 , 407-425. doi: 10.4236/nm.2019.104030 .
1. Introducción
Los términos vértigo, mareo e inestabilidad son utilizados de manera inconsistente por el público y los profesionales y existe una demanda general de una definición más precisa de vértigo en la práctica clínica como lo muestran Blakley et al. [ 1 ]. De todos modos, la prevalencia de por vida para el vértigo del 7.8% en la población general se estimó con un aumento significativo con la edad como lo publicaron Neuhauser et al. [ 2 ]. El vértigo es un síntoma, y dependiendo de su origen, el vértigo se distingue entre vértigo vestibular y vértigo no vestibular. El vértigo vestibular se distingue entre trastornos periféricos y centrales. A los trastornos vestibulares periféricos pertenecen la neuritis vestibular, el vértigo posicional paroxístico benigno, la enfermedad de Ménière y la vestibulopatía bilateral. El vértigo no vestibular tiene diferentes etiologías como trastornos metabólicos (diabetes mellitus), mareos inducidos por fármacos, desregulación ortostática, accidente cerebrovascular que afecta a otras áreas cerebrales y trastornos psiquiátricos (ansiedad, depresión). Aunque se definen una serie de condiciones específicas que pueden causar vértigo, la afección a menudo es multifactorial, principalmente en personas mayores, pero no se limita a ellas [ 2 ], lo que complica el diagnóstico y el tratamiento del síntoma. Por lo tanto, el enfoque diagnóstico y terapéutico debe ser multisistémico y orientado a los sistemas visual, propioceptivo y vestibular según Fernández et al. [ 3 ].
Varios estudios han investigado el medicamento VH-04. En un estudio clínico controlado, aleatorizado y doble ciego, Weiser et al. [ 4 ] compararon el tratamiento del vértigo con el tratamiento con betahistina. Se pudo demostrar en 105 pacientes en 15 centros de estudio, que recibieron VH-04 o clorhidrato de betahistina, que ambos tratamientos redujeron la frecuencia, duración e intensidad de los ataques de vértigo durante un período de tratamiento de seis semanas. Klopp et al. [ 5 ] realizaron un estudio abierto no aleatorizado con 32 pacientes, revelando que los parámetros de la microcirculación subcutánea, como lo evidencian las tasas de flujo de eritrocitos arteriolares y venulares, aumentaron a través de VH-04. Los estudios in vitro demostraron una vasorrelajación dependiente de la dosis en anillos de arteria carótida precontraídos aislados por fenilepinefrina. Los datos sobre la vasorrelajación y las mejoras microcirculatorias pueden indicar acciones conjuntas que proporcionan un primer indicio hacia un efecto antivertiginoso del VH-04, pero no explican los efectos combinatorios de sus ingredientes multicomponentes. Desentrañar el modo de acción del VH-04 sigue siendo un desafío porque posee un repertorio complejo de sustancias químicas que pertenecen a una variedad de clases de sustancias, lo que contrasta con las combinaciones de fármacos individuales definidas. Por lo tanto, el seguimiento de la actividad requiere una reconsideración de los métodos convencionales. Según Wink [ 6 ], la actividad farmacológica de las mezclas multicomponentes no se puede asignar a una sola sustancia, y los fitoquímicos contenidos suelen actuar de forma inespecífica y generalizada. Es la suma de actividades lo que posiblemente conduce a una potenciación de los efectos y promueve un resultado destacado. Por el contrario, se ha demostrado que el fraccionamiento o aislamiento de los componentes principales de los extractos termina en una pérdida de actividades detectadas previamente según Keith et al. [ 7 ]. Numerosas teorías proponen que la interacción e interferencia de componentes individuales en una mezcla es la razón de los efectos ventajosos de los medicamentos multicomponentes. Los conceptos básicos de acciones e interacciones conjuntas pueden resumirse en tres procesos principales: adición, sinergismo y antagonismo [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12]. Sin embargo, la respuesta a las sustancias en un sistema biológico altamente interconectado, como el cerebro, es muy compleja y rara vez lineal. Hay varios factores que pueden influir en la eficacia terapéutica de una sustancia, como la concentración intracelular efectiva de compuestos en la célula u órgano diana (p. ej. biodisponibilidad, bioconversión, farmacocinética), el microambiente químico y físico (p. ej. polaridad) en el sitio de interacción, el tipo de diana molecular (p. ej. moléculas individuales o múltiples, estructuras celulares) y la salud general de las células diana. El seguimiento holístico de la actividad de medicamentos complejos multicomponentes requiere una implementación de nuevas estrategias que permitan una visión general integrada de los procesos moleculares participantes.
2. Material y métodos
2.1. Material
VH-04 (Vertigoheel ® ) es un medicamento multicomponente y multidiana que se ha utilizado en el tratamiento del vértigo y el mareo de diversos orígenes durante muchos años en numerosos países de todo el mundo. Para inyección (1,1 ml) es una solución transparente, incolora e inodora con múltiples componentes ( Tabla 1 ). Para uso humano es inyectable por vía intramuscular (im), subcutánea (sc), intracutánea (ic) o intravenosa (iv). En este estudio se añadió etanol al 0,5 % v/v a
| Componente | Cantidad | Dilución |
|---|---|---|
| Anamirta cocculus | 7,7 mg | Dil.D3 |
| Conium maculatum | 1,1 mg | Dil. D2 |
| Ámbar grisea | 1,1 mg | Diluir D5 |
| Rectificador de petróleo | 1,1 mg | Dil. D7 |
| Otros componentes: cloruro de sodio y agua. |
El medicamento del estudio. Se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) dosis de 0,5 ml, 1,0 ml o 2,0 ml por kg de peso corporal (PC) de VH-04. El grupo de control del vehículo recibió cloruro de sodio (NaCl) al 0,9 % en volúmenes iguales, utilizando un grupo de control del vehículo separado para cada nivel de dosis con n = 11 por grupo.
En la Tabla 2 se ofrece una descripción general de las sustancias químicas específicas del receptor glutamatérgico . Todas las sustancias químicas se adquirieron en BioTrend Chemicals AG, Wangen/Zúrich, Suiza.
2.2 Animales y entorno de ensayo
Se realizaron estudios in vivo en veintidós ratas Fisher 344 ® de ocho meses de edad (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania) que se mantuvieron en jaulas estériles con tapa filtrante en un ciclo día/noche invertido y se les proporcionó comida y agua Ad libidum. La implantación de electrodos de acero concéntricos bipolares en el FC, el HC, el ST y el RF se logró mediante tornillos perforados en el cráneo y fijados con cemento dental rojo. Las señales se transmitieron de forma inalámbrica mediante un sistema radiotelemétrico (TSE-Systems GmbH, Bad Homburg, Alemania), utilizando 40 megahercios (MHz) como frecuencia portadora, y se amplificaron y procesaron para dar los espectros de potencia deseados con una resolución de 0,25 Hertz (Hz) según Dimpfel et al. [ 13 ]. A los animales se les concedió un período de recuperación de dos semanas antes del tratamiento farmacológico. El ciclo día y noche invertidos continuó durante todo el estudio. El estudio se realizó durante las cuatro semanas posteriores a la cirugía.
En la Figura 1 se documenta el curso temporal . Después de un registro basal previo al fármaco de cuarenta y cinco minutos, se administraron dosis únicas de VH-04 o de control del vehículo según lo indicado ( Figura 2 ). Después de un intervalo de recuperación de cinco minutos, se registraron las señales de EEG durante una hora. Se probaron diferentes dosis de VH-04 en un diseño cruzado. Se expuso a un total de once animales a una dosis del medicamento por experimento seguido de un intervalo sin fármaco de una semana. Se excluyó a un animal del grupo de dosis más alta debido a problemas técnicos. Principios de laboratorio (NeuroCode
| Sinónimo | Nombre químico | Número de lote | Función |
|---|---|---|---|
| CGS 19755 | Ácido cis-4-[fosfometil]-piperidina-2-carboxílico | 1A/33087 | Antagonista del receptor NMDA |
| NBQX | 2,3-Dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[f]quinoxalina-7-sulfonamida | 0608BN/02 | Antagonista del receptor AMPA |
| UBP301 | Ácido (αS)-α-amino-3-[(4-carboxifenil)metil]-3,4-dihidro- 5-yodo-2,4-dioxo-1(2H)-pirimidinapropanoico | 0532BN/01 | Antagonista del receptor de kainato |
| YM298198 | Clorhidrato de 6-amino-N-ciclohexil-N,3-dimetiltiazolo[3,2-a]bencimidazol-2-carboxamida | 0553BN/01 | Antagonista del receptor del grupo I del glutamato |
| (RS)-APICA | Ácido (RS)-1-amino-5-fosfonoindan-1-carboxílico | 0092BN/01 | Antagonista del receptor del grupo II del glutamato |
| Pronóstico del mercado de valores | (RS)-α-Metilserina-O-fosfato | 0349BN/01 | Antagonista del receptor del grupo III de glutamato |
| SYM2206 | 4-(4-aminofenil)-1,2-dihidro-1-metil-2-propilcarbamoil-6,7-metilendioxiftalazina | 7A/34998 | Antagonista del receptor AMPA |
| GYKI52466 | Clorhidrato de 4-(8-metil-9H-1,3-dioxolo[4,5-h][2,3]benzodiazepin-5-il)-bencenamina | 1A/735052 | Antagonista del receptor AMPA |
Tabla 2. Resumen de los antagonistas del receptor glutamatérgico, sus nombres químicos, sus números de lote y sus sinónimos.
Figura 1. Evolución temporal de las series experimentales.
Figura 2. Detalles de la administración.
2.3. Procedimientos
2.3.1. Cortes de hipocampo in vitro
Se obtuvieron cortes de HC de cuarenta y dos ratas Sprague Dawley ® macho adultas (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania). Las ratas se mantuvieron bajo un ciclo día/noche invertido durante dos semanas antes de los experimentos, con el fin de registrar la actividad in vitro en cortes durante la fase activa de su ritmo circadiano según Dimpfel et al. [ 14 ] y Dimpfel [ 15 ]. Los animales fueron sacrificados, se les extrajeron los cerebros y se aislaron los hipocampos bajo visión microestereoscópica. La sección media del HC se fija a la mesa de un micrótomo vibratorio utilizando un adhesivo de cianoacrilato, se sumerge en solución salina tamponada con bicarbonato fría y se corta en cortes de 400 μ de espesor. Todas las rodajas se preincuban durante al menos una hora en líquido cefalorraquídeo artificial saturado con carbógeno (ACSF; 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 , 2 mM MgSO4 , 26 mM NaHCO3 , 10 mM glucosa; pH = 7,4) en una precámara antes de su uso, según Dimpfel [ 15 ]. La metodología ha sido descrita anteriormente por Dimpfel [ 16 ] con más detalle. Durante el experimento, las rodajas se mantuvieron y trataron en una cámara de superfusión especial (List Electronics, Darmstadt, Alemania) según Haas et al. [ 17 ] y se mantuvieron a 35˚C como se informa en la literatura [ 18 ]. Se utilizaron cuatro rodajas de una rata por día en una de las condiciones de prueba, ya sea de control o concentraciones diferentes de la preparación de prueba. Después de obtener respuestas estables al estímulo singular (SS), se indujo una potenciación a largo plazo aplicando un patrón de tipo estímulo de ráfaga theta (TBS) [ 19 ].
2.3.2. Registro de EEG en vivo
Los animales fueron convertidos de día a noche para permitir el registro durante la fase activa. Los registros de EEG se realizaron a la misma hora del día para excluir los efectos circadianos. Durante el registro, las ratas pudieron moverse libremente pero no tuvieron acceso a la comida para evitar artefactos causados por la masticación. Las señales se transmitieron y procesaron para dar espectros de potencia de una resolución de 0,25 Hz como se describió anteriormente en Dimpfel [ 20 ]. Brevemente, los artefactos se rechazaron automáticamente y se recopilaron señales de unidades de 4 s y se realizó una transformación rápida de Fourier utilizando una ventana de Hanning, frecuencia de muestreo de 512 Hz. Se promediaron cuatro valores para dar una frecuencia de muestreo final de 128 Hz. Los espectros de potencia eléctrica resultantes se dividieron en seis rangos de frecuencia definidos ( Tabla 3 ). Los espectros se promediaron en intervalos de tres minutos durante el registro para supervisar la adquisición de datos y en intervalos de sesenta minutos durante el análisis fuera de línea para la evaluación final.
2.4 Análisis discriminante
Los efectos de VH-04 se compararon además con los de los fármacos de referencia utilizando veinticuatro variables, seis frecuencias por cuatro áreas cerebrales, mediante análisis discriminante lineal según Fischer, como se describió anteriormente en Dimpfel [ 21 ]. Los resultados de las primeras tres funciones discriminantes se proyectaron en el espacio, en los ejes X, Y y Z, mientras que los resultados de las siguientes tres funciones discriminantes se documentan mediante una mezcla aditiva de los colores rojo, verde y azul (RGB). Trabajos previos [ 20 ] [ 22 ] [ 23 ] revelaron que los productos medicinales sintéticos que interactúan con los neurotransmisores especiales (por ejemplo, norepinefrina, dopamina, acetilcolina, etc.) muestran patrones particulares de cambios de frecuencia. Además, estos cambios de frecuencia permitieron una asignación a diferentes clases de indicaciones (por ejemplo, ansiolíticos, antidepresivos, analgésicos, etc.). Las diferentes acciones de los productos medicinales se analizaron evaluando todos los cambios de frecuencia en las cuatro regiones cerebrales al mismo tiempo de manera estadísticamente significativa. Los resultados se representaron en seis dimensiones. La proyección de los datos del VH-04 en este gráfico de seis dimensiones permitió posicionar el medicamento en estudio dentro de una selección de doce medicamentos sintéticos de referencia específicos para cada indicación ( Tabla 4 ). Este posicionamiento es útil porque describe cuantitativamente las similitudes y diferencias relacionales con todos los medicamentos representados.
2.5 Análisis estadístico
Los promedios de las señales de EEG en µV 2 se expresaron como porcentaje de los valores basales previos al fármaco, y los datos de todos los animales por grupo se resumieron como media ± estándar.
| Nombre de la onda cerebral | Rango de frecuencia (en Hz) | Código de color |
|---|---|---|
| Delta | 0,80 - 4,50 Hz | Rojo |
| Theta | 4,75 - 6,75 Hz | Naranja |
| Alfa1 | 7,00 - 9,50 Hz | Amarillo |
| Alfa2 | 9,75 - 12,50 Hz | Verde |
| Beta1 | 12,75 - 18,50 Hz | Turquesa |
| Beta2 | 18,75 - 35,00 Hz | Azul |
| Sustancia | Dosis [mg/kg] |
|---|---|
| Fenitoína | 4.00 |
| Diazepam | 0,50 |
| Tacrina | 0,75 |
| L-Polamidona | 1.00 |
| Ziprasidona | 1.00 |
| Propofol | 60,00 |
| Moclobemida | 5.00 |
| Tramadol | 5.00 |
| Haloperidol | 0,50 |
| Cafeína | 1.00 |
| Metanicotina | 2.00 |
| Vertigoheel® (VH-04 ) | 1,00 [ml/kg] |
Tabla 4. Listado de compuestos de referencia utilizados para el análisis discriminante probado previamente por el experimentador. Se dan las dosis de los fármacos. Los compuestos se administran por vía intraperitoneal. Todos los fármacos se analizan durante 60 minutos después de la administración intraperitoneal, excepto la fenitoína (65 a 125 minutos).
Error de la media (SEM) durante la primera hora después de la administración. En los experimentos in vitro e in vivo, se identificaron diferencias significativas entre el medicamento experimental y el vehículo de control mediante la prueba U de Wilcoxon Mann-Whitney sin ajustes para comparaciones múltiples. Se consideraron significativos los valores p inferiores a 0,05.
3. Resultados
3.1. Cortes de hipocampo in vitro
Tras la estimulación eléctrica de descarga única (SS) a las colaterales de Schaffer, las respuestas de las células piramidales aumentaron de forma dependiente de la concentración en presencia de VH-04 ( Figura 3 ). La amplitud del pico de población aumentó, alcanzando su pico a 2 ml/L de VH-04, la amplitud aumenta de 1,07 a 1,73 mV. Existen diferencias estadísticas significativas entre esta tasa de aumento y el valor de control sin producto medicinal (p < 0,01). La siguiente dosis más alta de 4 ml/L de VH-04 mostró valores algo más bajos y, por lo tanto, una tendencia hacia una curva en “forma de campana”. Tras la estimulación eléctrica de ráfaga theta (TBS), la presencia de VH-04 solo condujo a una tendencia débil en los aumentos de la amplitud del pico de población, de 2,06 mV a 2,24 mV.
Para investigar objetivos particulares de VH-04, se agregaron varios antagonistas del receptor de glutamato al medio de superfusión del corte de HC (Figura 4). Las dosis apropiadas se determinaron mediante estudios piloto. Las concentraciones efectivas de VH-04 se tomaron de la primera serie de experimentos que se muestran en la Figura 3 , con 1 ml/L para VH-04. Para probar una posible interferencia de VH-04 con cambios de señal activados por el receptor NMDA, la neurotransmisión glutamatérgica
Figura 3. Efectos dependientes de la concentración de Vertigoheel (VH-04) sobre la actividad de las células piramidales en términos de cambios en las amplitudes de los picos de población después de la dilución de la preparación comercial como ml por litro (eje X). Resultados de cortes individuales obtenidos después de estímulos únicos (SS) o después de estímulos de ráfaga theta (TBS). Los datos se dan como media ± SEM de n = 6 cortes. La amplitud de la señal se da como voltaje en mV (eje Y). La curva inferior representa los cambios después de la estimulación con una sola descarga, la curva superior representa los cambios después de la estimulación con ráfaga theta. La significación estadística entre los efectos del control y VH-04 se marca de la siguiente manera: ***p < 0,01 según Wilcoxon, Mann y Whitney.
fue modulada por CGS 19755, un antagonista del receptor NMDA muy potente y selectivo según Bennett et al. [ 24 ]. En presencia de 250 nM de CGS 19755 solo, solo se pudieron medir disminuciones menores de la amplitud de la señal (Figura 4). Una concentración de 250 nM no antagonizó el aumento de amplitud en presencia de VH-04 después de un SS ( Figura 5 ). Por lo tanto, no se pudo observar ninguna interferencia con la transmisión de señal mediada por el receptor NMDA en presencia de VH-04. Para probar una posible interferencia de VH-04 con cambios de señal activados por el receptor AMPA, la neurotransmisión glutamatérgica fue modulada por NBQX, un antagonista competitivo del receptor AMPA muy potente y selectivo según Gill et al. [ 25 ]. En presencia de 50 nM de NBQX solo, no se pudo medir ningún cambio en la amplitud de la señal. Sin embargo, una concentración de 50 nM bloqueó la mejora significativa de la amplitud del pico de población en presencia de VH-04 después de SS (Figura 5).
Por lo tanto, para VH-04 se observó una clara interferencia con la transmisión de señal mediada por el receptor AMPA. Para probar una posible interferencia de ambos productos medicinales con cambios de señal activados por el receptor de glutamato AMPA no competitivo, la neurotransmisión glutamatérgica se moduló con GYKI 52466, un antagonista del receptor AMPA no competitivo muy potente y selectivo según Szabados et al. [ 26 ]. En presencia de 500 nM de GYKI 52466 solo, solo se midieron disminuciones muy menores de la amplitud de la señal. Una concentración de 500 nM de GYKI 52466 no antagonizó la amplitud aumentada en presencia de VH-04 después de SS ( Figura 5 ). Por lo tanto, no se observó ningún antagonismo con la transmisión de señal mediada por el receptor AMPA no competitivo para VH-04 después de SS. Sin embargo, en presencia de TBS, se vio un ligero aumento estadísticamente insignificante de la amplitud del pico de población ( Figura 5 ). Se obtuvieron resultados casi idénticos en presencia de SYM 2206 según Pelletier et al. [ 27 ], otro antagonista del receptor AMPA no competitivo ( Figura 5 ). Para probar una posible interferencia de VH-04 con receptores de kainato, la neurotransmisión glutamatérgica fue modulada por UBP 30, un antagonista del receptor de kainato competitivo muy potente y selectivo según More et al. [ 28 ]. En presencia de 50 nM de UBP 301 solo, no se pudo medir ningún cambio en la amplitud de la señal ( Figura 4 ). Sin embargo, una concentración de 50 nM antagonizó por completo la mejora estadísticamente significativa de la amplitud del pico de población en presencia de VH-04 después de SS ( Figura 5).). Por lo tanto, para VH-04 se observó una clara interferencia con la transmisión de señal mediada por el receptor de ácido kainato. Para determinar una posible interferencia de VH-04 con un receptor de glutamato metabotrópico de clase I, la neurotransmisión glutamatérgica se moduló con YM 298198, un antagonista del receptor de glutamato metabotrópico I muy potente y selectivo [ 29 ]. Durante la superfusión con 50 nM de YM 298198 solo, solo se pudo medir una disminución menor de la amplitud de la señal después de TBS ( Figura 4 ). Las amplitudes después de SS fueron
Figura 4. Efectos de concentraciones bajas de varios antagonistas del receptor de glutamato que actúan sobre el receptor NMDA, el receptor AMPA, el receptor de kainato y 3 receptores metabotrópicos de glutamato (Glu I, II, III) en comparación con los efectos del líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF). Los datos para SS están representados por las barras ligeramente sombreadas y los datos para TBS están representados por barras de color gris oscuro. El rango de datos de control está sombreado horizontalmente. La significación estadística entre los efectos del control y varios antagonistas del receptor está marcada de la siguiente manera: **p < 0,05, ***p < 0,01 según Wilcoxon, Mann y Whitney.
Figura 5. Efectos de Vertigoheel VH-04 (1 ml/L) en presencia de 8 antagonistas del receptor de glutamato. Los datos de SS están representados por las barras sombreadas claras, los datos de TBS están representados por las barras de color gris oscuro. El rango de datos de control está sombreado horizontalmente. La significación estadística entre los efectos de VH-04 solo y en presencia del compuesto activo del receptor está marcada: ***p < 0,01 según Wilcoxon, Mann y Whitney.
no cambió en presencia de VH-04 más el antagonista. Sin embargo, durante TBS se observó un pequeño aumento de la amplitud en presencia de VH-04 más el antagonista. Un antagonista del receptor de glutamato metabotrópico de clase II (RS)-APICA [ 30 ] a una concentración de 100 nM solo no inhibió la amplitud de la señal ( Figura 4 ). El efecto de VH-04 después de SS no se vio influenciado ( Figura 5 ). Un antagonista del receptor de glutamato metabotrópico de clase III MSOP [ 31 ] a una concentración de 50 nM solo no cambió la amplitud de la señal después de SS o TBS. El efecto de VH-04 después de SS no fue cambiado por este compuesto ( Figura 5 ). En resumen, el efecto de VH-04 solo fue antagonizado por un AMPA competitivo y un antagonista del receptor de kainato.
3.2. Registros de EEG en vivo
Los cambios de actividad eléctrica en varias localizaciones del cerebro registrados en presencia de VH-04 en diferentes dosis (el llamado electrofarmacogramo, EPG) se registraron continuamente durante una hora después de la administración del fármaco después de la línea base de cuarenta y cinco minutos de duración. Los cambios en la potencia espectral dentro de las cuatro regiones cerebrales después de la administración de solución salina fisiológica apenas pudieron detectarse, lo que se documenta para la primera hora después de la administración en la Figura 6. Los cambios de frecuencia espectral en presencia de la dosis más baja de VH-04 (0,5 ml/kg ip) se observaron predominantemente en la frecuencia alfa 2 en todas las áreas cerebrales, pero no alcanzaron significación estadística en comparación con la inyección de solución salina ( Figura 6 ). La duplicación de la dosis (1,0 ml/kg de peso corporal) proporcionó una imagen más profunda de los cambios de frecuencia espectral. Las frecuencias alfa 2 se atenuaron en todas las regiones cerebrales de manera estadísticamente significativa. Sin embargo, los cambios más fuertes se observaron en el FC y HC. Aquí, todas las frecuencias se atenuaron de manera significativa excepto alfa 1 y beta 2. También se observó una atenuación estadísticamente significativa de las ondas alfa 2 y beta 1 en el ST. Una administración de la dosis más alta de 2,0 ml/kg condujo a cambios de frecuencia espectral similares a los observados para la dosis más baja de 1 ml/kg. Se observó una atenuación altamente significativa de la potencia eléctrica en el FC, el HC y el ST con respecto a las frecuencias delta, theta, alfa 2 y beta 1 durante la primera hora después de la administración. Una atenuación estadísticamente significativa de las ondas alfa 1 ocurrió en el HC y el RF solo con la dosis más alta ( Figura 6 ).
Se observaron similitudes entre el patrón de cambio de frecuencia de 1,0 ml/kg exhibido por VH-04 y los de los compuestos de referencia, que se habían probado anteriormente en condiciones idénticas. Dos productos medicinales, la metanicotina, un análogo estable de la nicotina que actúa en el sistema colinérgico, y la tacrina, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, resultaron producir cambios muy similares en el contenido de frecuencia de los potenciales de campo. Además, la cafeína también indujo un patrón de frecuencia comparable, que se muestra en la Figura 7 .
Se realizó una comparación entre los patrones complejos de cambios de frecuencia mediante un análisis discriminante. Se obtuvieron de la base de datos veinticuatro variables y los patrones de 12 medicamentos de referencia clínicamente probados, que se habían probado anteriormente en condiciones similares. La proyección de los resultados del cálculo condujo a una separación obvia de la acción de los compuestos sobre
Figura 6. EPG que muestra el efecto dependiente de la dosis de Vertigoheel (VH-04) con respecto a cuatro áreas cerebrales y seis rangos de frecuencia desde delta (izquierda) hasta theta, alfa 1, alfa 2, beta 1 y beta 2. La ordenada muestra los cambios de potencia eléctrica en porcentaje de los valores iniciales. Las barras que apuntan hacia abajo representan la atenuación de la potencia. Los asteriscos representan la siguiente significación estadística: *p < 0,05; **p < 0,01 según Wilcoxon, Mann y Whitney.
Figura 7. Comparación de los efectos de Vertigoheel (VH-04) con los patrones de frecuencia evidenciados por los medicamentos de referencia en ensayos anteriores utilizando la misma metodología. Nótese que el patrón de frecuencia de VH-04 es muy similar al de los medicamentos de referencia. Se observan efectos comunes con respecto a las ondas alfa 2 y delta (marcadas en verde y rojo). Los asteriscos representan la siguiente significación estadística: *p < 0,05; **p < 0,01 según Wilcoxon, Mann y Whitney.
el cerebro en función de los cambios en el contenido de frecuencia del EPG. Las tres coordenadas espaciales se utilizaron para las tres primeras funciones discriminantes y los resultados de las tres segundas funciones discriminantes se representaron en los colores rojo, verde y azul (el llamado modo RGB). Por lo tanto, los cambios de actividad específicos de la indicación se pueden visualizar de una manera más interpretable agrupando la proyección de los compuestos de referencia. La Figura 8 documenta esta agrupación específica de la indicación. Estas agrupaciones se corresponden bastante bien con las indicaciones de los libros de texto farmacológicos. En primer lugar, el espacio tridimensional evidencia la similitud o disimilitud de la acción del fármaco. Además, los colores iguales o similares sugieren mecanismos de acción similares. La posición y el color de los compuestos de referencia con indicaciones clínicas conocidas se enumeran en la Tabla 4. Los medicamentos inyectados ip se analizan para determinar su acción durante la siguiente hora después de la administración. La preparación VH-04 se analiza durante el tiempo de 5 a 65 minutos después de la administración. VH-04 está representado por una dosis de 1,0 ml/kg y marcado como “Vertigoheel” (VH-04). El EPG de VH-04 se proyecta cerca de los medicamentos que mejoran la cognición, Tacrina y Metanicotina. VH-04 también se proyecta cerca de la cafeína, como sustancia química estimulante.
Simultáneamente con el registro telemétrico, se monitoreó el movimiento de las ratas que se movían libremente. No se observaron cambios evidentes en el movimiento en presencia de VH-04 en comparación con el control de NaCl al 0,9 %. La Tabla 5 muestra los cambios en el movimiento.
Figura 8. Análisis discriminante de EPG que proporciona patrones similares de cambios de frecuencia espectral para indicaciones clínicas similares. Los compuestos que tienen un efecto similar aparecen en estrecha proximidad entre sí (ver ejes X, Y y Z). Una gran similitud con respecto a las señales de espacio y color indica un mecanismo de acción similar y efectos clínicos similares [ 13 ].
| Movimiento | ||||
|---|---|---|---|---|
| Tiempo | 0,9% de NaCl | VH-04 | VH-04 | VH-04 |
| 5 - 65 minutos media ± SEM | 1,0 ml/kg 148 ± 30 | 0,5 ml/kg 143 ± 20 | 1,0 ml/kg 134 ± 23 | 2,0 ml/kg 129 ± 12 |
Tabla 5. Efectos del VH-04 sobre el movimiento de las ratas.
Durante la primera hora después de la administración del medicamento. Los valores medios se expresan en ± error estándar de la media. La comparación estadística con los resultados del control se determinó mediante la prueba U de Wilcoxon, Mann y Whitney.
4. Discusión
En este informe, demostramos que VH-04 es capaz de alterar la firma EEG de ratas, por lo que podría caracterizarse como un medicamento activo en el SNC. Hemos optado por un método holístico para analizar su modo de acción sistemáticamente in vivo e in vitro. La inyección ip de VH-04 atenuó de forma dosis-dependiente las ondas delta, theta, alfa 2 y beta 1 en el HC, así como en el FC. En el ST y el RF, se observaron cambios más pequeños en las señales EEG, pero solo alcanzaron significación estadística en el ST a 1 ml/kg y en el RF a la dosis más alta de 2 ml/kg. La atenuación de las ondas alfa 2 en el HC y el FC, podría interpretarse como una activación del sistema dopaminérgico, porque los agonistas del receptor de dopamina atenúan las ondas alfa 2 y los antagonistas del receptor dopaminérgico aumentan las ondas alfa 2 en este sistema de prueba [ 20 ]. La corteza prefrontal y la formación de HC están densamente inervadas por aferentes dopaminérgicos, y el aprendizaje y la memoria están fuertemente modulados por la actividad de la acetilcolina y la dopamina. Hay alguna evidencia de que el sistema de la noradrenalina afecta la incorporación de recuerdos, involucrando la modulación de la plasticidad sináptica [ 32 ]. Curiosamente, se ha demostrado que tanto las estimulaciones visuales como las vestibulares influyen en la potencia y la frecuencia de las ondas delta, theta y alfa del EEG en varias regiones cerebrales de los humanos [ 33 ].
Como resultado del análisis, el análisis discriminante mostró ciertas similitudes en comparación con la metanicotina y la tacrina colinérgicas que mejoran la cognición, como lo demuestra su posicionamiento en la Figura 8, particularmente indicado por la proximidad de VH-04 al medicamento de referencia [ 21 ]. Muchos medicamentos alopáticos para el vértigo incluyen compuestos anticolinérgicos que deterioran las funciones cognitivas. Sin embargo, esto es altamente especulativo y necesita ser examinado en estudios adicionales. Los efectos hipotéticos del VH-04 sobre la cognición son justificables en relación con su eficacia en el tratamiento del vértigo vestibular [ 34 ], lo que sugiere que la información proporcionada por el sistema vestibular afecta directamente al HC. Por lo tanto, si la entrada vestibular se ve impedida por una disfunción vestibular bilateral [ 35 ] o una pérdida vestibular bilateral crónica [ 36 ], la memoria espacial se ve afectada en los seres humanos. Además, la pérdida vestibular da lugar a una atrofia del HC [ 36 ]. Si, por el contrario, el sistema vestibular se estimula mediante irrigación calórica o estimulación eléctrica del oído interno, los procesos cognitivos se aceleran en los seres humanos y la memoria puede mejorar [ 37 ] [ 38].
Otro factor es que el VH-04 ejerce efectos vasorrelajantes, presumiblemente regulando la contracción o relajación de las células musculares lisas, y hay evidencia preliminar de una estrecha relación entre la función de los vasos de resistencia y el rendimiento neuropsicológico [ 39 ]. La malperfusión hemisférica y la regulación alterada del flujo sanguíneo cerebral están potencialmente relacionadas con el deterioro cognitivo [ 40 ]. Para el VH-04 se demostraron mejoras microcirculatorias subcutáneas causadas por el VH-04 [ 5 ]. La picrotoxina, un antagonista de GABA y un metabolito secundario de Anamirta cocculus previno los deterioros cognitivos en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer, según Yoshiike et al. [ 41 ]. La exposición directa del HC in vitro a varias concentraciones de VH-04 condujo a aumentos significativos de la amplitud del pico de población después de SS. Se probaron varios antagonistas específicos del receptor de glutamato para atenuar los aumentos inducidos por el VH-04 de las amplitudes del pico de población. Sólo los compuestos que interactúan con el AMPA y el receptor de ácido kainico atenuaron los efectos de VH-04. Dingledine [ 42 ] postula que aquí hay amplia evidencia de que la preparación de rebanadas de HC in vitro proporciona un método efectivo para investigar la estructura de comunicación del cerebro con respecto a los parámetros neurofisiológicos. De especial interés son los parámetros sustitutos, que reflejan características cognitivas. Dos parámetros dominan el análisis de la función de HC in vitro. El primero consiste en la respuesta a la estimulación de las colaterales de Schaffer por SS, lo que resulta en la excitación de las células piramidales. El segundo es el inicio de la potenciación a largo plazo después de la estimulación de ráfaga theta. Ambos parámetros aumentan en presencia de memantina, un medicamento antidemencial para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, ver Dimpfel [ 43 ]. VH-04 en concentraciones bastante bajas, dilución de 1:4000 de la preparación original, fue capaz de aumentar estas respuestas. Estos datos corroboran los datos electrofisiológicos obtenidos durante el curso de experimentos in vivo en la segunda parte de la presente investigación, donde el EPG obtenido en ratas proporciona evidencia de una acción estimuladora de VH-04 en varias regiones cerebrales. Los receptores de kainato juegan un papel crucial en el control de la integración sináptica y la eficacia de la transmisión de picos en las sinapsis de fibras musgosas HC y están altamente implicados en el procesamiento de información espacial [ 44 ]. Según Johnson et al. [ 45 ], un mecanismo de potenciación de AMPA podría estar relacionado también con la neuroprotección. Con respecto a los potenciales de campo y la neurotransmisión, Dimpfel [ 15] Se utilizaron fármacos más o menos específicos con influencia conocida sobre la neurotransmisión para examinar una relación entre los potenciales de campo y la actividad de los neurotransmisores. Numerosos antagonistas y agonistas de los receptores de dopamina, noradrenalina, serotonina, glutamato y acetilcolina provocaron cambios reproducibles del contenido de frecuencia. Esto indica que los cambios en estos rangos de frecuencia tienen un significado fisiológico. Sin embargo, la interpretación de estos cambios de frecuencia es limitada, ya que la actividad de varios neurotransmisores puede cambiar simultáneamente en respuesta a un fármaco. Por lo tanto, a menudo solo es posible asignar un cambio dominante dentro de un rango de frecuencia particular a un neurotransmisor específico.
5. Conclusión
Llegamos a la conclusión de que el VH-04 tiene una actividad significativa en el SNC y que afecta significativamente a las ondas alfa 2 en todas las áreas cerebrales. Las observaciones preliminares revelaron ciertas similitudes de actividad con los fármacos que mejoran la cognición, pero se requieren más experimentos para respaldar este concepto. Los estudios preclínicos deben investigar más a fondo los posibles efectos del VH-04 en la memoria y la cognición y, si se pueden verificar estos efectos, para dilucidar aún más su mecanismo de acción.
Contribuciones de los autores
W. Dimpfel y B. Seilheimer fueron responsables del diseño del estudio.
W. Dimpfel desarrolló la metodología y fue responsable de la interpretación de los resultados.
L. Schombert realizó los experimentos.
B. Seilheimer proporcionó la preparación y la información farmacológica del medicamento.
B. Seilheimer y W. Dimpfel participaron en la redacción del manuscrito.
Expresiones de gratitud
El estudio recibió el apoyo financiero de Biologische Heilmittel Heel GmbH, D-76532 Baden-Baden, Alemania. Se agradece enormemente la ayuda del Dr. Stephan Duller, Graz, Austria, en la preparación del manuscrito.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.
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